Молекулярная генетика и молекулярная биология

Зарождение молекулярной генетики

Эпоха молекулярной генетики начинается с работ, доказавших ведущую роль ДНК в передаче наследственной информации. Важ­нейшими шагами стали расшифровка структуры ДНК, триплетного генетического кода, описание механизмов биосинтеза белка, обна­ружение ферментов рестриктаз и разработка методов секвенирования ДНК. После открытия структуры ДНК в биологии начался неви­данный по скорости прогресс, было сделано десятки важнейших открытий, почти все из которых были отмечены Нобелевскими преми­ями в области биологии и медицины. Однако рассмотрим все эти эпохальные достижения по порядку.

Учёным предстояло прояснить несколько важнейших вопросов, а именно: 1) каким образом происходит репликация ДНК в процессе клеточного деления; 2) как реализуется такая первичная функция ге­нов как управление биосинтезом белков. Следует сказать, что еще в 1941 г. Дж. Бидл и Э. Тейтум сформулировали концепцию «один ген — один белок». Решение последней задачи фактически означало вы­яснение не только механизма биосинтеза белка, но и расшифровку генетического кода.

В 1957 г. американский биохимик Артур Корнберг (1918 — 2007 гг.) выделил из бактерий фермент ДНК-полимеразу, которая осуществляет синтез двух новых антипараллельных цепей на матрице материнских цепей ДНК по полуконсервативному механизму, как и предсказывали Уотсон и Крик. Найдены были ферменты, которые раскру­чивают двухспиральную молекулу ДНК, делая возможным процесс удвоения, в то время как дочерние молекулы закручива­ются в спирали самостоятельно. В рамках выяснения механизма биосинтеза белка был установлен аналогичный фермента­тивный механизм синтеза РНК на матрице ДНК. В 1959 — 1961 гг. сразу несколько групп исследователей открыли фермент ДНК-зависимую РНК-полимеразу, которая осуществляет переписывание информации с последовательности нуклеотидов ДНК на язык РНК (процесс транскрипции). В ре­зультате этого процесса образуется одноцепочечная информационная РНК (и-РНК), которая служит матрицей для синтеза белка.

Более сложным являлся вопрос о механизме синтеза полипептидной молекулы в соответствии с последовательностью нуклеотидов в РНК, т. е. механизма трансляции (перевода информации с языка нуклеиновых кислот на язык белков). Фактически речь шла, наряду с выяснением основных стадий биосинтеза белка, о расшифровке ге­нетического кода. Суть рассуждений сводилась к следующему. Так как количество кодирующих знаков генетического кода (4, в соответ­ствии с числом нуклеотидов) и число различных аминокислот в бел­ках (20) не совпадают, кодовое число (т. е. количество нуклеотидов, кодирующих 1 аминокислоту) не может быть равно 1. Можно пред­ставить себе, что одну аминокислоту кодируют пары нуклеотидов, тогда различных сочетаний по 2 нуклеотида возможно лишь 42=16, что также недостаточно для зашифровки всех аминокислот.

В решении этой задачи активное участие принимал выдающий­ся физик-космолог Георгий Антонович Гамов (1904 — 1968 гг.). В прошлом он был студентом Новороссийского университета, а впо­следствии, став известным советским физиком-теоретиком, уехал за границу и стал невозвращенцем. Георгий Гамов в 1954 г. предложил модель триплетного генетиче­ского кода, в котором 1 аминокислоту ко­дирует группа из трёх нуклеотидов, назы­ваемая триплетом или кодоном. Число возможных триплетов равно 43=64, а это более чем втрое превышает число извест­ных аминокислот, в связи с чем было вы­сказано предположение, что каждой ами­нокислоте соответствует несколько кодонов, а не один уникальный кодон. Бы­ло предложено много различных моделей генетического кода, среди которых выде­лялись три: перекрывающийся код без запятых, неперекрывающийся код без запятых и код с запятыми.

В 1961 Ф. Крик с сотрудниками получил экспериментальное подтверждение гипотезы триплетного неперекрывающегося кода без запятых. Установлены следующие основные характеристики генети­ческого кода: 1) между последовательностью нуклеотидов и кодиру­емой последовательностью аминокислот существует линейное соот­ветствие (колинеарность); 2) считывание начинается с определённой точки и идёт в одном направлении в пределах одного гена; 3) код яв­ляется неперекрывающимся (т. е. триплет следует за триплетом, без перекрывания между соседними триплетами); 4) при считывании не бывает промежутков (код без запятых); 5) генетический код является вырожденным, т. е. 1 аминокислоту кодируют 2 и более триплетов-синонимов (вырожденность кода уменьшает вероятность того, что мутационная замена какого-либо основания в триплете приведёт к ошибке); 6) кодовое число равно трём; 7) код универсален, т. е. оди­наков у всех живых организмов, от дрожжей до человека.

Универсальность кода была вскоре подтверждена эксперимен­тами по синтезу белка in vitro, т. е. в бесклеточных системах. Если в бесклеточную систему, полученную из одного организма (например, кишечной палочки), добавить РНК-матрицу, полученную из другого организма, далеко отстоящего от первого в эволюционном отноше­нии (например, проростков гороха, или ткани печени крысы), то в такой си­стеме будет идти белковый синтез. Благодаря работам американских ге­нетиков М. Ниренберга, С. Очоа, Р. Холли и X. Кораны в 1961 — 1965 гг. стал известен не только состав, но и порядок нуклеотидов во всех кодонах. Маршалл Уоррен Ниренберг (1927-2010 гг.) применил ориги­нальную идею, впоследствии удосто­енную Нобелевской премии — синте­зировал РНК, состоящую только из урацила (поли-U) и получил в бескле­точной системе белок, состоящий только из фенилаланина. Используя варианты этого подхода, были найдены все остальные коды аминокислот в ДНК. Работа над рас­шифровкой кода была завершена.

Развитие молекулярной генетики и молекулярной биологии

Стандартный генетический код, полученный в результате опы­тов с кишечной палочкой, представлен в таблице 1.1. В РНК вместо тимина содержится урацил, поэтому (как представлено в первой ко­лонке) в РНК код будет читаться с буквой U. Как видно из таблицы, аминокислота фенилаланин кодируется 2-мя триплетами, аминокис­лота метионин — только одним триплетом, а аминокислота лейцин — 6-ю. Обозначение Stop в таблице означает, что данный кодон — это сигнал окончания трансляции. Из 64 кодонов у бактерий и фагов эту роль выполняют 3 кодона: УАА, УАГ и УГА, они не кодируют ами­нокислот и служат указателем отсоединения полипептидной цепи от рибосомы. Их называют терминирующими кодонами. Существуют также 3 сигнала о начале синтеза белка — это инициирующие кодоны (АУГ, ГУГ и УУГ), которые находятся в начале участка соответству­ющей информационной РНК (и-РНК) и определяют включение в пер­вое положение синтезируемой полипептидной цепи аминокислоты формилметионина. Оказалось, что все белки синтезируются, начиная с этой модифицированной аминокислоты, которая потом удаляется специальным ферментом.

Расшифровка генетического кода имела огромное значение. Все эти достижения позволили понять механизм биосинтеза белка, т. е. реализации генетической информации и фор­мирования всех генетически обусловленных признаков.

Таблица 1.1. Стандартный генетический код

T (U) С А G
T (U) ТТТ Рhе
ТТС Рhе
ТТA Leu
ТТG Leu
ТСТ Ser
ТСС Ser
ТСА Ser
ТСG Ser
ТАТ Тyr
ТАС Тyr
ТАА Stop
ТАG Stop
ТGТ Cys
ТGС Cys
ТGА Stop
ТGG Тrр
C СТТ Leu
СТС Leu
СТА Leu
СТG Leu
ССТ Рго
ССС Рго
ССА Рго
ССG Рго
САТ Нis
САС Нis
САА Gln
САG Gln
СGТ Аrg
СGС Аrg
СGА Аrg
СGG Аrg
A АТТ Ilе
АТС Ilе
АТА Ilе
АТG Met
АСТ Thr
АСС Thr
АСА Thr
АСG Thr
ААТ Аsn
ААС Аsn
ААА Lys
ААG Lys
АGТ Ser
АGС Ser
АGА Аrg
АGG Аrg
G GТТ Val
GТС Val
GТА Val
GТG Val
GСТ Аlа
GСС Аlа
GСА Аlа
GСG Аlа
GАТ Аsp
GАС Аsp
GАА Glu
GАG Glu
GGТ Gly
GGС Gly
GGА Gly
GGG Gly

Реализация генетической программы в клетке происходит в два этапа. Первый из них протекает в ядре, он носит название тран­скрипции и заключается в синтезе молекул и-РНК на соответствую­щих участках ДНК. При этом последовательность нуклеотидов ДНК «переписывается» в нуклеотидную последовательность РНК. Второй этап (трансляция) протекает в цитоплазме, на рибосомах. При этом последовательность нуклеотидов и-РНК переводится в последова­тельность аминокислот в белке. Этот этап протекает при участии набора из 20-ти транспортных РНК (т-РНК), специфически связы­вающих 20 аминокислот, и ряда ферментов, природа и функции кото­рых полностью изучены. Все это позволило Френсису Крику в 1961 г. сформулировать т. н. «центральную догму молекулярной биологии», согласно которой движение информации происходит в направлении:

ДНК → РНК → Белок

Однако вскоре эта догма была опровергнута, поскольку в конце 60-х годов Г. Темин открыл в составе РНКовых вирусов РНК-зависимую ДНК-полимеразу, которая синтезирует ДНК на матрице одноцепочеч­ной РНК. Впоследствии этот фермент получил название обратной транскриптазы или ревертазы. Теперь стало возможным представ­ленную выше схему изобразить по-иному.

ДНК  ↔‍ РНК → Белок

Дальнейшее развитие науки шло по пути уточнения важных де­талей — выяснения механизмов регуляции функций генов и изучения механизмов исправления ошибок при репликации ДНК. Успехи на этих направлениях привели к разработке Ф. Жакобом и Ж. Моно схе­мы управления работой генов по принципу обратной связи. Была вы­двинута гипотеза, что гены, отвечающие за синтез белков-ферментов, регулирующих взаимосвязанные или последовательные реакции, объединены в функциональные блоки — опероны.

Помимо этих достижений большое значение имело обнаружение ферментов, осуществляющих вырезание «ошибочных» оснований или их дефектов и замену новыми. Этот механизм получил название эксцизионной репарации ДНК, он объяснял, каким образом повре­ждения, вызванные ионизирующей радиацией, или спонтанно воз­никшие в процессе репликации ДНК, могут быть исправлены самой клеткой, восстанавливая исходную последовательность.

Следующей важной вехой в развитии молекулярной генетики стало обнаружение в 1970 г. при изучении бактерии Haemophilus influenzae ферментов рестриктаз, которые позволяют вырезать и встраивать участки молекул ДНК, причём в строго определённых ме­стах, узнавая специфические последовательности азотистых основа­ний. С этого момента в руках учёных появился мощный инструмент, с помощью которого можно было извлекать из ДНК (длина молекулы которой невероятно велика по сравнению с диаметром) участки же­лательных размеров, причём с помощью рестриктаз набор фрагмен­тов можно регулировать. Используя эту технологию, стало возмож­ным извлекать из геномной (целостной) ДНК нужные фрагменты, встраивать их в векторы (например, в ДНК вирусов) и такую реком­бинантную ДНК размножать (клонировать) в любых требуемых ко­личествах. Эта процедура, получившая название молекулярного кло­нирования (не путать с клонированием организмов) лежит в основе генной инженерии.

Появление генной инженерии

Генная инженерия может быть использована с технологически­ми (внедрение в бактериальную клетку генов с целью производства необходимых белков, например, человеческого инсулина) или меди­цинскими целями (внедрение в клетку человека «здорового» гена взамен существующего дефектного). Если первое уже успешно реа­лизуется, то второе пока является в большей степени направлением для поисков. К сожалению, внедрить в геном «хороший» ген взамен неисправного удаётся пока только на короткое время. Однако навер­няка вскоре эта проблема также будет решена.

Развитие молекулярной генетики как науки и набора технологий в значительной степени связано с разработкой новых методов иссле­дования ДНК и РНК. Тот прогресс, который наблюдается сегодня, был связан с разработкой двух важнейших методических подходов — определения последовательности азотистых оснований в ДНК (секвенирования) и специфической ферментативной амплификации ДНК in vitro (полимеразной цепной реакции, или ПЦР). Секвенирование ДНК вначале было громоздкой и длительной процедурой, связанной с синтезом РНК на матрице ДНК и изучением последовательности основа­ний в РНК. В последующем были разработаны более простые и быст­рые методы, а сегодня эта процедура, особенно с использованием компьютерных технологий, стала более простой и эффективной. Если в 1977 г. Ф. Зангером, У. Гилбертом и А. Максемом была впервые секвенирована ДНК небольшого бактериофага (вируса бактерий), то вскоре, уже в 1989 Ф. Коллинс и Лап-Че Цуи впервые секвенировали ген человека. Это был ген, кодирующий белок CFTR, дефекты в по­следовательности которого приводят к развитию опухолей. В 1995 г. был впервые полностью секвенирован геном целостного организма невирусной природы — бактерии Haemophilus influenzae, а в 1996 впервые — геном эукариотного организма (пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae). В 1998 г. впервые полностью секвенирован геном многоклеточного эукариотного организма — крошечного круг­лого червя-нематоды Caenorabditis elegans.

Можно было начинать секвенирование человеческого генома. К работе приступили две организации — международный консорциум университетских и научно-исследовательских лабораторий Human Genome Project и коммерческая фирма Celera Genomics. Работа про­должалась несколько лет, общие затраты на проект составили около 400 млн. долл. В 2001 г. были обнародованы первые наброски полной последовательности генома человека, а 14 апреля 2003 г. (раньше, чем планировалось) проект «геном человека» был успешно завершён, 99 % генома было секвенировано с точностью 99,99%. Интересно, что Celera Genomics слегка опередила государственные лаборатории, поскольку взяла на вооружение компьютерные методы, что позволи­ло работать быстрее и с меньшими затратами. Сегодня на таких веб­сайтах, как Gene, HomoloGene, OMIM, RefSeq и др. все заинтересо­ванные лица могут ознакомиться с картами генов на всех человече­ских хромосомах, гомологичными генами в геномах различных ви­дов, последовательностями миллионов нуклеотидов в любом интересующем гене или его участке.

Что касается полимеразной цепной реакции (ПЦР), то она была запатентована К. Муллис как метод исследований в 1986 г. Мы не будем вдаваться в подробности метода, отметим лишь, что он осно­ван на использовании ДНК-полимеразы, полученной из термофиль­ных микроорганизмов, размножающихся при температуре порядка 80°С. Именно термофильная ДНК-полимераза позволяет размножить искомый ген в любом имеющемся материале и таким образом обна­ружить его. Новый метод дал также возможность получать большие количества ДНК, с его помощью была решена проблема клонирова­ния ДНК-копий редких молекул РНК, скрининга геномных библио­тек, выявления генных мутаций и дефектных генов, физического кар­тирования хромосом. Сегодня ПЦР в различных модификациях стала рутинным методом и широко используется в медицинских целях, например, для быстрого выявления генных дефектов или с целью уточнения диагноза бактериальных и вирусных инфекций (в этих случаях в организме человека ищут участки генома микроорганизмов или вирусов). ПЦР также применяется для идентификации личности и поэтому нашла широкое применение в криминалистике. С помо­щью ПЦР можно в любом биологическом и небиологическом мате­риале найти интересующую исследователя молекулу ДНК или её фрагмент, причём речь может идти в буквальном смысле слова об одной молекуле или её незначительном фрагменте. В последние годы на смену ПЦР пришли новые, ещё более эффективные методы, в частности метод, основанный на применении ДНК-микрочипов. С его помощью можно в автоматизированном режиме сканировать огром­ное количество (сотни тысяч) полиморфизмов (участков в гомологич­ных молекулах ДНК, отличающихся по последовательности азоти­стых оснований). На основе накопления знаний о структуре и характеристиках генома человека и животных сформировалась новая наука — геномика.

Перспективы использования методов молеку­лярной генетики и развития молекулярной биологии

Подводя итог, следует сказать, что благодаря развитию молеку­лярной генетики и молекулярной биологии перед генетикой человека открылись новые перспективы. В настоящее время в сотнях между­народных проектов изучается роль генов в возникновении различных болезней, в том числе, психических расстройств. Есть большие до­стижения в области изучения причин рака и механизмов старения. Появились реальные возможности изучать связь конкретных генов с определёнными формами поведения и чертами личности. Большие перспективы для медицины связаны с разработкой методов ранней диагностики наследственных заболеваний. Много нового мы узнаем об эволюции человека, его генетическом родстве с ближайшими и отдалёнными родственниками (приматами и млекопитающими), о степени сходства между расами и народностями, об их происхожде­нии, распространении по Земному шару, т. е. фактически об их исто­рии. Сегодня можно сказать, что генетика как наука чрезвычайно расширилась и включает в себя следующие крупные разделы: класси­ческая генетика, популяционная генетика, молекулярная генетика, геномика, медицинская генетика, генная инженерия.

Источник: Розанов, В. А. Биология человека и основы генетики: Учебное пособие / В. А. Розанов. – Одесса: ВМВ, 2012. – 435 с.

Связанные статьи:

Почему генетика в СССР была объявлена лженаукой?

Этапы становления генетики как науки

Связь биологии человека с другими науками

Гены, ДНК и РНК: понятие, структура, репликация, мутации

Ответить

Ваш e-mail не будет опубликован.

Вы можете использовать HTML- теги и атрибуты:

<a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>