Международный проект по расшифровке генома человека

Развитие молекулярной генетики и клеточной биологии открывает перед человечеством большие перспективы улучшения диагностики и повышения эффективности лечения распространённых и опасных заболеваний. Появляются новые возможности в области эволюционной биологии человека, уточняется степень родства людей и их ближайших родственников — человекообразных обезьян и наших общих ископаемых предков. Получено много интересных данных о генетическом родстве различных народов, разработаны новые методы идентификации личности, что имеет значение для криминалистики.

Наибольшие усилия предпринимаются на медицинском направ­лении, учитывая практическое значение новых данных для человече­ства. Активно изучается генетический компонент наиболее распространённых неинфекционных заболеваний человека (кардио­васкулярная и цереброваскулярная патология, атеросклероз, сахар­ный диабет, заболевания суставов и т. д.). Интенсивно исследуется генетическая основа психических расстройств. Значительный про­гресс наблюдается в области генетики поведения и во многих других важных для человечества областях, например, таких как изучение причин и механизмов формирования различных аддикций (алкоголь­ная и наркотическая зависимость, игровая зависимость и т. д.). Получены новые доказательства генетических механизмов суицидального поведения. В результате быстрого внедрения новых методов форми­руются такие важные направления современной науки, как биологи­ческая психология и психиатрия.

С другой стороны, быстро развивающиеся методы клеточной биологии (клонирование) и способы манипулирования стволовыми клетками в сочетании с новыми методиками управления работой генетического аппарата клеток («отключение» определённых генов или внедрение новых генов в геном) открывают такие возможности, какие совсем недавно казались недостижимой фантазией. Эти возможности появились, прежде всего, потому, что наука сильно продвинулась вперёд в понимании структуры генома человека и разработала ряд важных и очень практичных методов, которые уже сегодня приносят результаты.

Расшифровка человеческого генома

Одним из наиболее известных достижений генетики последнего десятилетия является расшифровка генома человека. Этому крупному международному проекту предшествовали расшиф­ровка генома нескольких микроорганизмов и фагов (вирусов), растений и насекомых.

Фредерик Сэнгер

Фредерик Сэнгер (1918-2013)

Методику установления последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК разработал выдающийся учёный XX века Фредерик Сэнгер, ав­тор более ранней методики установления последовательности аминокислот в белках, дважды лауреат Нобелевской премии в об­ласти химии (в 1958 и 1980 годах). Важным до­стоинством метода стало то, что его можно было автоматизировать, это превратило сложную и трудоёмкую процедуру в отно­сительно простую и недорогую техническую задачу. Теперь процесс установления последовательности нуклеотидов сводился к тому, чтобы разрезать человеческую ДНК на относительно короткие участки, установить последовательность нуклеотидов в каждом из них и со­ставить полную нуклеотидную карту генома. От английского слова sequence, что означает «последовательность», в молекулярной гене­тике появился русский термин «сиквенс», а процедура установления последовательности получила название секвенирования.

Когда начался проект по расшифровке генома человека

Проект секвенирования человече­ского генома (Human Genome Project) начался в 1990 году. Задача проек­та проста — установление последовательности нуклеотидов, которая представляла бы полностью каждую из хромосом человека, от первого нуклеотида до последнего, а также создание генетических и физических карт хромосом. Вообще-то, строго говоря, хромосомная ДНК — это ещё не вся ДНК человеческого организма, поскольку существует ещё митохондриальная ДНК. Её структура изучалась отдельно, что было относительно несложно из-за её небольших размеров.

Джеймс Дьюи Уотсон и Крейг Вентер

Джеймс Дьюи Уотсон (род. 1928 г.) и Крейг Вентер (род. 1946 г.). Вентер был первым, кто секвенировал и опубликовал свой собственный диплоидный геном, а Уотсону сиквенс его генома был преподнесён в подарок к 80-летию

К работе приступил международный консорциум университетов и научно-исследовательских лабораторий, которым с 1988 года руководил «отец ДНК» Джеймс Уотсон. Несколько позже работу на этом же направлении начала коммерческая фирма Селера Дженомикс (Celera Genomics) под руководством Крейга Вентера. В первом случае предметом исследований была геномная ДНК от нескольких человек, представителей различных рас и народностей. Имена этих людей сохранялись в тайне. Собственно, они и сами не знали о том, что их ДНК стала первой человеческой расшифрованной до конца ДНК, поскольку их кровь была случайным образом отобрана из многочисленных проб крови, взятых у различных людей. Во втором случае ДНК была получена от 5 человек, которые являлись соучредителями компании.

Технологические приёмы в международном консорциуме и коммерческой фирме были разными. В первом случае ДНК разрезали в заданных местах с по­мощью ферментов рестриктаз на фрагменты, которые распределяли между лабораториями и после секвенирования каждого из фрагментов восстанавливали исход­ную структуру (контиг) сначала по группам секвенированных участков, а затем и всю молекулу. Во втором случае исследова­тели бессистемно разру­шали ДНК на множество мелких фрагментов, а для расшифровки исходной последовательности были использованы от­крытые данные консорциума и возможности суперкомпьютеров с многократным «прочтением» коротких фрагментов. Первая (черновая) версия последовательности нуклеотидов была закончена в 2000 году. В 2003 году (на 2 года раньше, чем ожидалось) было объявлено о полной расшифровке генома человека, причём Селера Дженомикс подготовила свою версию раньше международного консорциума. Конечная версия после исправления всех неточностей была завершена в 2004 году, она содержит около 3-х миллиардов пар нуклеотидов. Точность полученной последовательности — 1 ошибка на 100 тысяч позиций подряд. Об окончании работы было объявлено в торжественной обстановке в присутствии администрации США, причём Дж. Уотсон и К. Вентер на церемонии выступали на равных. Это событие стало знаковым, поскольку открыло эпоху коммерческого секвенирования.

Геном человека и результаты его расшифровки

Секвенирование человеческого генома было научной задачей огромной сложности и беспрецедентного масштаба. Ускорение и относительно быстрое решение задачи было достигнуто за счёт использования большого числа роботов-секвенаторов, работавших круглосуточно, эффективного менеджмента и использования приёмов биоинформатики с применением суперкомпьютеров с большими объёмами оперативной памяти и огромной скоростью переработки информации. Опыт, накопленный в ходе реализации этого проекта, стал важной вехой в развитии управления современной наукой, которая является результатом деятельности больших коллективов. Публикация о расшифровке человеческого генома в журнале Nature была представлена таким большим числом соавторов, что их перечисление заняло несколько страниц. В последнее время в статьях такого рода ради экономии места на страницах журналов полные списки авторов не публикуются, а размещаются в интернете.

Полная последовательность нуклеотидов ДНК человека получи­ла название референтной последовательности, её можно найти в ин­тернете. На основе полученных результатов созданы важные базы данных, в частности, о последовательности нуклеотидов транскриби­руемых участков ДНК (EST database, EST означает Expressed Sequence Tags), база данных полиморфизмов SNP Database (база нук­леотидных замен, SNP — Single Nucleotide Polymorphism) и др.

Существует также база данных по генам, мутации которых при­водят к заболеваниям и которые ведут себя как менделевские призна­ки, именуемая OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), база HapMap (карта гаплотипов) и другие источники. Вся эта информация размещена в сети интернет и является открытой, о чём было догово­рено в самом начале проекта. Специалисты в данной области всю ин­формацию черпают в интернете, поскольку руководства и монографии в данной области быстро устаревают, практически в процессе написания.

В ходе секвенирования приходилось решать множество сложных проблем. Геном человека имеет ряд особенностей, которые отнюдь не упрощают задачу, но на секвенирование это не повлияло. Значительно сложнее всё обстояло с картированием генома. Проблема состоит в том, что у человека по понятным причинам невозможно произвольное скрещивание, и поэтому анализ многих генов сильно затруднён. В то же время, для построения физических и генетических карт человеческих хромосом необходимо уметь обнаруживать генетическое сцепление генов, рассчитывать их относительное расстояние на хромосомах. Мы не будем вдаваться в детали тех методов, с помощью кото­рых задача всё же была решена. Большую роль в этом сыграла база данных многодетных семей, в которых можно было взять пробы крови у 3-4 поколе­ний (от прадедов до правнуков). Естественно, найти множество таких семей было нелегко — число их сегодня в мире не превышает 100.

Важным моментом, который сыграл решающую роль в установ­лении правильного порядка секвенированных фрагментов, было наличие в геноме полиморфных сайтов. Мы знаем, что два гомоло­гичных гена могут отличаться всего одним нуклеотидом. В некото­рых случаях это приводит к значительным изменениям структуры кодируемого белка. Но очень часто совсем не обязательно такая за­мена будет сопровождаться каким-либо функциональным результа­том, поскольку продукт (белок) может оказаться неизмённым. Во-первых, замена может произойти в некодирующей части ДНК (в интронах, повторах и т. д.). Во-вторых, как мы помним из информации о генетическом коде, порой только первые два нуклеотида в триплете являются важными, третий может меняться.

Таким образом, в геноме человека накапливается огромное ко­личество «безвредных» замен, которые, распределяясь по всей длине хромосомы, порождают полиморфные сайты, которые выступают как маркерные локусы или генетические маркеры. Если идентифици­ровать эти локусы вдоль всей молекулы, задача восстановления пра­вильной последовательности разрезанных фрагментов становится менее сложной. Такая идентификация возможна благодаря тому, что известны многочисленные бактериальные ферменты — рестриктазы, которые способны расщеплять ДНК в строго определённых участках, узнавая те или иные маркерные последовательности в ДНК. Рестриктаз известно много, все они выделены (в основном, из микроорганиз­мов) в чистом виде, каждая узнаёт свою последовательность и, комбинируя их между собой, ДНК каждой хримосомы разрезают на участки различной длины, сопоставляя последовательности которых потом строят физические карты хромосом.

Современная карта хромосомы

Рис. 1. Современная карта хромосомы. Представлена самая маленькая человеческая хромосома — № 21. Её ДНК состоит из 46.944.323 пар оснований, содержит 243 известных гена, 87 псевдогенов, 131.740 SNP. Первая колонка — расположение генов, вторая — частота GC-повторов, третья — расположение SNP, четвёртая — общий вид хромосомы и номенклатура её участков

Такая карта для 21-й хромосомы представлена на рис. 1.

Основным методом выявления ДНК-маркеров стал метод ам­плификации (размножения) фрагментов ДНК іn vitro с точностью до нуклеотида с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод основан на использовании термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из термофильных мик­роорганизмов. Уникальной особенностью этих микро­организмов является то, что они живут и размножаются при высоких (порядка 80ºС) температурах внешней сре­ды. Используя методику ПЦР, можно синтезировать любой фрагмент ДНК іn vitro и получить его как химически чистое вещество. В качестве затравки для синтеза используются короткие синтетические полинуклеотиды — праймеры. За один цикл достройки новой ДНК из двух нитей получается 4. В следующем цикле, занимающем всего несколько минут, из 4 нитей получится уже 8 и т. д. За 30 циклов ПЦР искомый фрагмент размно­жится в миллиард раз, что позволяет легко его идентифицировать (после электрофореза в геле и прокраски специальным красителем).

Значение расшифровки генома человека

Сегодня методика ПЦР активно используется в медицине, напри­мер, в целях выявления генома вирусов или микроорганизмов в крови человека. Одновременно развиваются ещё более производительные и дешёвые методы, в частности метод микрочипов, что позволяет решать всё более масштабные задачи.

Одним из примеров такой масштабной задачи стало генотипирование 3192 европейцев, проживающих в различных странах и регионах Европы по более чем полумиллиону сайтов полиморфизма одновременно. Полученные данные после статистической обработки методом главных компонент позволили представить графически на плоскости группы людей с учётом их генетическо­го сходства. В итоговом варианте группа в 1400 человек была представлена в пространстве более чем 200 тысячами признаков. Полученная картина оказалась очень близкой к географической карте Европы (португальские и испанские геномы оказались западнее всех, немецкие — в центре, итальянцы расположились южнее французов, а последние — южнее англичан и шотландцев). Пользуясь полученной «картой», родину 90 % испытуемых можно указать с точностью до 500 км.

В будущем, по мере удешевления методов изучения геномов, будут использоваться не поиск отдельных полиморфизмов, а секве- нирование целых геномов (это происходит и сейчас, но не так массо­во). Получаемые данные после обработки на суперкомпьютерах будут сопоставляться на географической карте с границами прожива­ния этносов, распространённостью различных заболеваний, граница­ми распространения языков и наречий и т. д. Всё это позволит делать как фундаментальные, так и прикладные, важные для медицины вы­воды. По мере уточнения генетических механизмов тех или иных за­болеваний всё больше будет усиливаться профилактическая роль медицины, поскольку всё большее число людей будет иметь возмож­ность получить сиквенс своего собственного генома.

Источник: Розанов, В. А. Биология человека и основы генетики: Учебное пособие / В. А. Розанов. – Одесса: ВМВ, 2012. – 435 с.

Другие статьи:

Механизм рака, или Канцерогенез опухоли: причины и риск развития

Биохимические процессы в организме человека и гены

Морфогенез человека и влияние на него генов

Частота генотипа в популяционной генетике человека

Загрузка...

Ответить

Ваш e-mail не будет опубликован.

Вы можете использовать HTML- теги и атрибуты:

<a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

Загрузка...